چهره بالینی این بیماری آنقدر متغیر است که هرگز نمی‌توان تنها بر پایه علائم و نشانی‌های بیماری آن را تشخیص داد، به‌همین دلیل تشخیص بیشتر بر پایه اعتماد به آزمایشگاه در نشان دادن و مشاهده عامل بیماری و دقت روشهای سرولوژیکی استوار است. معمولاً تشخیص بیماری از طریق یافتن آنتی بادی بیماری به روش سرولوژی یا پیدا کردن DNA لپتوسپیرای سویه بیماریزا به روش های مولکولی در خون صورت می‌گیرد. جهت شناسایی بیماری لپتوسپیروزیس از خون (1 تا 2 میلی‌لیتر سرم خون)، مایع نخاع و ادرار (10 تا 25 میلی‌لیتر از ادرار میانی) نمونه‌برداری می‌گردد. برای تشخیص بیماری لپتوسپیروزیس از روش‌های زیر استفاده می‌شود:

الف) آزمایش مستقیم: خون، مایع نخاع و ادرار را ابتدا برای جداسازی عناصر سلولی و بعد در دور بالا برای جداسازی باکتری سانتریفوژ کرده و سپس از رسوب گسترش تهیه نموده و پس از رنگ‌آمیزی فونتانا با میکروسکوپ نوری و یا تهیه  Wet mount توسط میکروسکوپ زمینه سیاه به مشاهده باکتری می‌پردازند. از لحاظ شکل ظاهری گونه‌های بیماری‌زا و  غیربیماری‌زا (ساپروفیت‌ها) لپتوسپیرا از یکدیگر قابل تفکیک نیستند و بهترین وسیله برای مشاهده این اجرام، استفاده از میکروسکوپ زمینه تاریک است. لپتوسپیرا با رنگ‌های آنیلینی بخوبی رنگ‌آمیزی نمی‌شوند. تکنیک‌های رنگ‌آمیزی نقره در جنین‌های سقط شده و رنگ‌آمیزی با قرمز کنگو در مورد رسوبات ادراری می‌تواند مفید باشد.

ب) کشت: نمونه برداشت شده را می‌توان در محیط کشت نیم جامد فلچر (Fletcher) ، محیط مایع تریپتکاز سوی براث (TSB)Trypticase-soy broth )، محیط کشت مایع EMJH broth Mc callongh, Johnson. Harris) Ellingehaasen)، محیط مایع کورتوف ((Khortof، محیط جامد یا مایع  bovine serum albumin –Tween 80 و محیط مایع استوارت (Stuart) کشت داد. اگر به محیط Khortof، ماده 5 فلورویوراسیل (200 µg/mL) و فسفومایسین اضافه شود، محیط انتخابی می‌گردد. برای ایزوله سروتیپ‌های سخت رشد بایستی به محیط‌ها، سرم خرگوش اضافه نمود. توصیه می‌گردد که برای جداسازی بالای باکتری، نمونه‌ها در چهار لوله مختلف کشت داده شوند و میزان تلقیح نمونه در محیط کشت خیلی زیاد نباشد (چراکه تلقیح زیاد در رشد باکتری تداخل می‌کند). نمونه ادرار را باید هر چه سریعتر کشت داد، زیرا pH  اسیدی ممکن است سبب نابودی باکتری گردد.کشت‌های انجام شده در حرارت 30 درجه سلسیوس برای مدت 8-6 هفته انکوبه می‌شود و در هر هفته یک قطره از نمونه کشت را برداشت نموده و توسط میکروسکوپ زمینه سیاه مشاهده می‌نمایند. باید توجه داشت که در محیط‌های نیمه جامد، لپتوسپیراها به صورت حلقه 5/0 تا 1 سانتیمتری در زیر سطح محیط رشد می‌نمایند. لپتوسپیرا در هفته اول از نمونه‌های خون و CSF توسط کشت قابل جداسازی می‌باشد، ولی از ادرار می‌توان تا یک ماه آن را ایزوله نمود.

ج) روش‌های سرولوژی: از روش‌های سرولوژیک مانند آگلوتیناسیون (MAT)، هماگلوتیناسیون غیرمستقیم، ایمنوفلورسانس غیرمستقیم (IFA) ، الیزا (ELISA) و … می‌توان به شناسایی بیماری پرداخت. اختصاصی‌ترین روش تعیین سروتیپ باکتری، روش هماگلوتیناسیون می‌باشد. یک تست اسلاید آگلوتیناسیون یا الیزا، آنتی‌بادی را در سرم نشان می‌دهد.

تشخیص زودهنگام به دلیل اینکه فاز اول لپتوسپیروزیس علائمی شبیه سرماخوردگی دارد و چون آنتی‌بادی قابل تشخیص در این مرحله ظاهر نمی‌شود، خیلی مشکل است. معمولاً میزان آنتی‌بادی قابل اندازه‌گیری ضد لپتوسپیرا، در روز 6 تا 12بیماری و ماکزیمم در هفتة سوم و چهارم وجود دارد.

د) تزریق به حیوان آزمایشگاهی: از روش‌های حساس برای شناسائی لپتوسپیرا تزریق به هامستر و خوکچه هندی است.

ه) جداسازی آنتی‌ژن و اسید نوکلئیک: با استفاده از آنتی‌بادی منوکلونال می‌توان آنتی‌ژنهای لپتوسپیراها را در ادرار یا نمونه‌های دیگر شناسائی کرد. تکنیک‌های مولکولی مانندPCR، DNA پروب و روش REA (Restriction Endonuclase Analysis) با حساسیت و اختصاصیت بالای 95 درصد برای شناسائی اسید نوکلئیک لپتوسپیراها در بعضی از آزمایشگاه‌های پیشرفته انجام می‌شود.